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辣椒素与羟丙基-β-环糊精的络合及其分析应用

2021-04-12 admin 29

  辣椒是茄科的一员。该物种似乎起源于墨西哥南部,然后延伸到哥伦比亚。现在,辣椒属香料是最常被消费和非常重要的商业世界。辣椒素最早于1816年被发现,其化学名称为8-甲基-n -香草酰基-反式-6-非酰胺,是辣椒中最活跃的成分。辣椒素有助于辣椒的风味、辛辣和辣味,同时它也对镇痛、消炎、预防胆固醇和肥胖有很大的作用。因此,它是食品工业中衡量辣椒品质的一个重要指标。此外,辣椒素具有氧化稳定性、抗菌性、抗癌性等特点,因此在医药领域得到了广泛的应用。随着食品添加剂和药品对辣椒素的需求不断增加,有必要开发一种快速、简便、灵敏的辣椒素测定方法。到目前为止,辣椒素的测定方法有很多,包括高效液相色谱、气相色谱、光谱学和毛细管电泳等。这些分析方法可以提高辣椒素测定的准确性和可靠性。然而,它们大多是在有机介质中,在严格的反应条件下,使用昂贵的仪器来实现的。因此,迫切需要一种简便、低成本、灵敏、准确的辣椒素测定方法。

  环糊精(CD)是一种由D-吡喃葡萄糖单元组成的环状寡聚物。其中最常用的是β-环糊精(β-CD)和7个D-吡喃葡萄糖单位。CDs具有内疏水外亲水的空心截锥结构,具有与客体分子形成主客体配合物的性质。配合物明显提高了客体分子的物理性能、化学性能和生物学性能。HPβCD是2-羟丙基-β-环糊精的缩写,是指β-CD的羟基烷基衍生物。在HPβCD的分子结构中,羟丙基的引入可以打破分子内的氢键,使HPβCD比天然β-CD获得更大的疏水腔和更强的水溶性。HPβCD不仅广泛应用于食品、化妆品、制药等领域,而且广泛应用于分析化学。通过与HPβCD合显著增强荧光强度,建立了多种灵敏度高的测定水溶液中药物的新方法。

 该研究利用荧光光谱法研究了不同条件下HPβCD与辣椒素的主-客体包涵体相互作用。使辣椒素的荧光强度可以明显增强,建立了一种测定辣椒中辣椒素的新方法。实验结果表明,该方法具有简单、快速、线性范围宽等特点,可成功地应用于辣椒样品中辣椒素的测定。


1. 荧光研究

  辣椒素在277 nm激发时,在312 nm处发出荧光(图1黑色曲线)。添加CDs后,辣椒素的荧光增强,并发生了约2 nm(312→310 nm)的轻微蓝移。这可能是由于CDs空腔对辣椒素从激发态和非极性环境的弛缓提供了限制,辣椒素分子经历了从水中的极性环境向CDs的极性空腔的转变。辣椒素在水溶液、β-CD溶液和HPβCD溶液中的荧光量子产率分别为0.10、0.11和0.15。HPβCD腔为辣椒素分子提供了较好的保护微环境,从而提高了辣椒素的荧光量子产率。

2. 荧光光谱法的条件优化

2.1 pH值的影响

  体系的pH值会影响客体的荧光性质,对HPβCD与辣椒素包合物的稳定性有很大的影响。在样品溶液中加入HPβCD,辣椒素固定在5.0 × 10−3M,辣椒素固定在1.0 × 10−5M。由于CDs在很低的pH值下是不稳定的,所以避免使用含有HPβCD的强酸性溶液是合理的。因此,在缓冲溶液中考察pH值在3.0-10.0范围内对体系的影响。从图2A可以看出,在pH值5.0-7.0范围内荧光相对较强,并保持稳定。因此,用Briton-Robinson缓冲液固定pH值为6.0。


2.2 HPβCD浓度的影响

  当辣椒素浓度稳定在1.0 × 10−5M, HPβCD浓度在0.0 ~ 7.0 × 10−3M范围内变化时,对HPβCD浓度的影响。图2B为辣椒素在溶液中逐步加入HPβCD时荧光信号逐渐增加的过程。当HPβCD浓度达到5.0 × 10−3M时,荧光强度最大当进一步添加HPβCD时略有改变。结果表明,HPβCD浓度为5.0 × 10−3M。


2.3 添加试剂的顺序和反应时间对辣椒素荧光强度的影响

  结果表明:辣椒素、Briton-Robinson缓冲液、HPβCD的添加顺序为最佳。探讨了反应时间对荧光强度的影响。在加入试剂10分钟后,复合物的荧光强度最强,并在至少1小时内保持稳定。因此,选择反应时间为10分钟。

3. 络合物的化学计量学

  配合物的化学计量学通过乔布的方法得到了确认。图3所示的图显示了峰值处的最大值含量约为0.67,表明配合物的化学计量比为1:2 (HPβCD:辣椒素)。



4. 相溶解度的研究

  通过相溶解度图测定络合物的表观稳定性和增溶能力。在0~50 mM HPβCD范围内,辣椒素的溶解度呈负偏差(图4A)。根据Higuchi和Connors模型,它应该归因于AN型溶解度剖面。表观稳定常数k为3.76× 106M−2,由相溶解度图初始线性部分(图4B)确定,计算公式为:其中s0为辣椒素在HPβCD缺失情况下的水溶性。在50mM HPβCD的存在下,辣椒素的溶解度提高了25.4倍。



5. 包合物表征

5.1 1H NMR

  通过1H NMR谱可以直接指示包合物的形成,通过宿主和客体所选质子的化学位移变化可以预测包合模式。H-3和H-5质子位于HPβCD腔内,H-3靠近宽边,而H-5则相反。而包涵体形成后,外部质子(H-1、H-2和H-4)的化学位移变化较小。图5为HPβCD(a)和辣椒素/HPβCD包合物(b)的1H NMR谱图。HPβCD中的质子H-3和H-5分别表现出−0.034和−0.024 ppm的上移(蓝线)。由于客体分子中含有芳香基团,因此产生了各向异性磁效应。H-3质子的化学位移比H-5更明显。由此推断,辣椒素的芳香基团可能靠近HPβCD腔的宽侧。



5.2 热分析

  热分析被广泛应用于包合物的表征。与HPβCD络合后,客体分子的熔点、沸点和升华点可能转移到不同的温度或消失。图6为辣椒素、HPβCD、物理混合物以及包合物的热分析曲线(TG和DSC)。从HPβCD的TG图(图6A)可以看出,有两个失重温度范围:50-100℃和330-380℃。与DSC曲线相对应,前者与HPβCD的失水有关,后者与HPβCD的分解有关。在图6B中辣椒素的DSC热图中,在60℃处有一个急剧的吸热峰,对应于辣椒素的熔点。323℃时放热较宽,表明化合物发生了分解。物理混合物中游离辣椒素和HPβCD的吸热峰呈简单的叠加,表明在物理混合物中宿主与客体分子没有相互作用。辣椒素/ HPβCD包合物的DSC热像图显示其与物理混合物和游离化合物有明显的差异。观察到与水释放相对应的宽吸热带。然而,该波段的峰值向较低的温度移动了4.52°C。此外,游离辣椒素和物理混合物中辣椒素的熔点(60℃)在复合物形成后消失。具体来说,如图6B所示,辣椒素在复合物中的失重发生在328°C,而在物理混合物中的失重发生在262°C。因此,在加热过程中,复合物中辣椒素的失重得到了延缓。结果表明,HPβCD具有提高辣椒素热稳定性的作用。



5.3 分子建模研究

  分子模型研究了宿主-客体相互作用,以确定包合物最可能的模式以及适当的三维可视化的复合体。实验结果表明,两个辣椒素分子与一个HPβCD分子之间存在一定的化学计量关系。首先,在宿主-客体相互作用的情况下,辣椒素与HPβCD的相互作用呈现出两种不同的方向(图7a)。在芳香基团- In模式下,辣椒素与HPβCD之间的OH-O氢键稳定包合物。相比之下,在芳香分子的moiet-out模式中,只发现宿主和客体分子之间的范德华力。表1列出了两种可能络合的形成束缚自由能,计算依据式(2)。从△G值可以看出,芳香组分的moiey-in模式(−23.38 kcal/mol)比芳香组分的moiey-out模式(−11.05 kcal/mol)稳定得多。因此,第二步(1:2主客互动)采用芳香的moiety-in模式。1:2主客体相互作用,芳香moiety-in-in模式和芳香moiety-in-out模式的ΔG值−40.05−36.88千卡/摩尔,分别为(表1),这是发现在四个模式,最主要的配置是芳香moiety-in-in的模式——两个辣椒素分子芳香的根插入一个HPβCD腔由于疏水作用和氢键(Fig.7B左)。





6. 分析参数

  该复合物的形成增强了辣椒素的荧光强度,具有很大的应用潜力。因此,建立了一种快速简便的荧光光谱法测定HPβCD溶液中辣椒素的含量。在最佳实验条件下,荧光强度与辣椒素浓度在0.05 ~ 60 μg/mL范围内呈良好的线性关系,线性回归方程为F = 715.73+ 938.93ρ (μg/mL),相关系数为0.9982。在IUPAC的定义中,检测限为0.04 μg/mL, RSD为1.30%。此外,还建立了无HPβCD时辣椒素的校正曲线。在0.5 ~ 6.0 μg/mL范围内,线性回归方程为F = 134.75+ 609.14ρ (μg/mL),检出限为0.32 μg/mL。当辣椒素与HPβCD络合时,HPβCD在极低浓度下增强了辣椒素的荧光响应。而在高浓度的辣椒素溶液中,HPβCD的空腔降低了辣椒素分子在水溶液中的碰撞概率。因此,可以得到荧光光谱法测定辣椒素的方法HPβCD的线性范围更广,分析灵敏度更高。

7. 外来干扰效应

  系统研究了外源干扰对0.50 μg/mL辣椒素含量测定的影响,方法参考黄等人。对无机离子(Na+,Zn2+和Cl−)超过2000倍,Ca2+,K+和PO43−超过1000倍,Fe3+和抗坏血酸超过20倍,没有干扰作用。

8. 分析应用程序

  辣椒粉样品按上述方法提取。然后分别用本方法和高效液相色谱法对样品提取物进行测定。结果如表2所示,在置信水平(P) = 95%时,两种方法之间没有显著差异。用加样回收率评价方法的准确性。结果如表3所示。从表中可以看出,回收率为99.5-105.6%。





结论

  综上所述,该研究以1:2的主客比制备了辣椒素/HPβCD复合物。通过荧光光谱、相溶解度研究、核磁共振氢谱、热分析和分子模拟等手段对包合物的形成进行了表征。实验结果表明,该配合物的最稳定模式为一个HPβCD腔包覆两个辣椒素分子的芳香基团。与HPβCD络合后,辣椒素的水溶性和热稳定性得到了明显改善。此外,在增强辣椒素荧光强度的基础上,建立了HPβCD存在下快速荧光光谱法测定辣椒素的新方法。结果表明,该方法具有较低的检测限、较高的检测精度和较好的实用性。

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