环糊精包咖啡因，好还是不好呢？发表时间：2021-12-21 17:33 咖啡因（Cafine）是嘌呤生物碱，具有许多有益作用。几个世纪以来，人们一直在使用咖啡因的特性来改善认知能力，最初是通过咀嚼咖啡豆，如今则通过饮用咖啡豆浸液和含咖啡因的饮料来提高认知能力。咖啡因也对各种代谢性疾病和肥胖症有治疗效果。由于咖啡因是一种小的非极性分子，因此非常适合与环糊精(CD)络合。   选取斑马鱼为研究对象 斑马鱼与人类有超过70%的遗传特征和高度保守的发育和分子过程，因此选取斑马鱼胚胎为研究对象，“鱼类胚胎急性毒性（FET）测试”通常用于获取脊椎动物化学物种的急性或致命毒性。 研究内容 合成 在不存在或存在几滴水的情况下，或通过蒸发诱导的等摩尔水溶液沉积在研钵中用研杵将等摩尔混合物共研磨30min来制备咖啡因的固体CD复合物(Caf@CDs)。在等摩尔水溶液沉积方法中，使用了旋转蒸发器，它比通常的冷冻干燥方法简单得多。在共研磨之前，将CD干燥，因为这些物质被提供了高含量的水（高达百分之十二），这可能导致无效的摩尔比估算。 粉末X射线衍射（PXRD）  对于α-CD和β-CD系列产品获得的PXRD图谱相似。通过不加水的共研磨获得的产物显示出低结晶度。另一方面，在水的存在下共研磨得到的产物和水溶液的蒸发都显示出高结晶度。在后两种情况下，PXRD图谱与类似混合物的图谱相似。因此，可以得出结论，水干扰了咖啡因与α-CD或β-CD的结合。 对于γ-CD络合物观察到相反的情况。Caf @ γ-CD2和Caf @ γ-CD3的平坦PXRD图案均显示其非晶态特征。另一方面，Cafγ -CD1是结晶的，其PXRD图谱与对应的混合物（Caf +γ-CD1）相似。因此，水的存在似乎是咖啡因与γ-CD络合的必要条件。此外，Caf +γ-CD1的PXRD图谱包含水合的γ-CD3的信号，而不是干燥的γ-CD1的信号。因此，该样品包含从空气中吸收的水分是合理的。该观察结果还可以得出结论，在γ-CD配合物的情况下，水的存在在热力学上是有利的。 差示扫描量热法（DSC） 从干燥CD(Caf + CD1)获得的混合物的热分析图显示出可能来自新形成的相的新信号。但是，PXRD测量排除了所有正在研究的混合物中形成新相的可能性。与无水混合物相比，在水的存在下，所提供的热量不影响这种混合物的热行为。 振动光谱  振动光谱法支持PXRD和DSC分析的结果，即在不存在水的情况下通过共研磨可以获得具有α-CD和β-CD的固体咖啡因复合物，尽管主体和客体分子之间可能没有强相互作用。研究的其他合成方法似乎没有成功。 分子模拟  分子建模可以用作表征CD作为宿主和小的有机分子作为主客体之间结合行为的工具。密度泛函理论(DFT)方法被证明是研究CD配合物的强大工具，将高计算效率与所需的精度相结合。 计算分两个阶段进行。首先，分子对接被应用来有效地产生低能量姿势。然后在DFT级别优化最低能量的配合物。第二阶段在有和没有应用可极化连续体模型(PCM)溶剂化方案的情况下进行，以确定水对络合物的结构和能量的影响。 对于Caf@α-CD，最稳定的构象是咖啡因分子位于CD分子较宽边缘附近的构象。该取向允许在主体和客体分子之间形成两个H键，即在N9和O2之间作为受体，并且形成α-CD的C4原子的羟基的H原子作为供体。发现由于分子位阻，通过分子对接而使咖啡因垂直于α-CD平面方向的取向在能量上不太有利。 在结构咖啡因的方向Caf@β-CD被认为是类似于Caf@α-CD。同样，咖啡因分子位于CD分子较宽的边缘附近，N3处的甲基位于内部，而另两个甲基则位于外部。但是，在这种复合物中，CD腔的较大尺寸使咖啡因分子能够更深地渗透，这是由于非极性咖啡因分子与β-CD疏水腔之间的吸引力所致。 对于Caf@α-CD和Caf@β-CD而言，发现溶剂化复合物的能量都比非溶剂化复合物的能量低。这与实验性PXRD观察结果一致，即水干扰咖啡因与α-CD或β-CD之间的缔合。 对于Caf@γ-CD, 获得了客体分子的不同取向。由于与α-CD和β-CD相比，γ-CD腔的尺寸增加, 咖啡因分子可能藏在疏水腔内部并形成真正的包合物。发现咖啡因的取向垂直于γ-CD，并且在这种取向下，咖啡因的甲基都没有从γ-CD突出。在这种CD的情况下，发现溶剂化物的能量低于其非溶剂化物的能量。这与基于PXRD分析结果的结论很好地吻合，该结论指出，在γ-CD配合物的情况下，水的存在在热力学上是有利的。 毒性  斑马鱼模型用于分析各种化学物质的毒性。我们发现，斑马鱼胚胎在后来的时间（从48至72 h受精后）用相同浓度的咖啡因处理24小时显示出体长减少。而从4 hpf（囊胚中期）开始的治疗效果更为严重，即在所有存活的胚胎中引起高死亡率和严重畸形。在所有从4 h受精后暴露于咖啡因的存活胚胎中，在24 h受精后时观察到较不透明的身体，不发达的眼睛和大脑，尾巴和卵黄囊延伸受损以及形状异常的体节。 无论处理鱼的阶段如何，高达5 mM的γ-CD浓度都不会影响胚胎发育。此外，用5 mM的β-CD处理对胚胎发育没有影响，而5 mM的α-CD引起100％的死亡率。必须将α-CD的浓度降至1.25 mM，以免引起致畸作用。 由于已知与CD的结合会减弱API的生物学功能，因此测试了咖啡因与三种天然CD结合时的作用，并将其与纯组分的毒性进行了比较。与单独的咖啡因或CD相比，Caf @ CD表现出更明显的作用。5 mM Caf@γ-CD严重削弱了融合延伸，导致胚胎的形态受到严重影响，而5 mM Caf@β-CD或1.25 mM Caf@α-CD导致处理过的胚胎死亡。根据处理20小时后的分解程度（在24 h受精后下）判断，将胚胎暴露于5 mM α-CD,≥1.25mM Caf@α-CD和5mMCaf@β-CD在治疗开始后不久死亡。因此，CD复合物的生物学特性可能高度依赖于API。 斑马鱼胚胎中的咖啡因水平 已知CD会影响药物的化学、物理和热稳定性以及它们的生物利用度，包括由于形成复合物而增加的药物溶出度和溶解度。由于鱼是用完全溶解的物质处理的，因此Caf@CD毒性增加的可能性不大可能是由于咖啡因的溶解度较高。然而，络合可能例如通过降低咖啡因的疏水性并因此增加其吸收来影响咖啡因的生物利用度。为了验证这一点，使用了高效液相色谱(HPLC)来测定斑马鱼胚胎和幼虫中已暴露于咖啡因或Caf @ CD的咖啡因含量。持续0、5、10、15、30、45、60分钟和24小时。对于所有测试化合物（咖啡因，获得了类似的曲线Caf@α-CD、Caf@β-CD和Caf@γ-CD），标记为0分钟暴露的测量（快速浸没在测试溶液中，然后用E3培养基洗涤3次）由于信号非常低而无法定量咖啡因，这表明我们的测定确实对应于斑马鱼体内的咖啡因，并且不受干扰。该化合物结合到斑马鱼胚胎或幼虫的皮肤上，咖啡因的摄取很快。暴露5分钟后，很容易检测到咖啡因。咖啡因以Caf@的形式提供与纯咖啡因或Caf@α-CD和Caf@β-CD相比，γ-CD在暴露的前15分钟内显示出稍大的积累。测试化合物吸收的微小差异可能是由于系统迅速饱和所致。不幸的是，所测水平接近线性下限，因此我们无法在较低浓度下进行那些测定。将需要更灵敏的方法和/或增加数量的斑马鱼胚胎来测量从更稀溶液中摄入的咖啡因。如此小的差异似乎具有生物学重要性。但是，由于仅咖啡因以Caf @的形式提供γ-CD表现出这种趋势，而毒性最高的复合物Caf@α-CDs中摄取的咖啡因与纯咖啡因的摄取具有相似的特征，因此可以合理地得出结论，摄取的差异不能解释其增加的原因。Caf@CD的生物毒性需要进一步的研究，以确定致畸作用是否可能由协同毒性引起。  用于获得固态CD的API复合物的标准方法可能非常费力且费时。例如，对于光盘的API cogrinding在高能量研磨机通常进行1小时以上。根据这项工作中报告的结果，应该有可能使用低能共研磨，这由于其简单性和减少的生产时间而很理想。使用本文提出的共研磨方法，30分钟的时间足以获得具有α-CD和β-CD的咖啡因复合物。此外，蒸发诱导的沉积似乎会产生咖啡因与γ-CD的复合物，因此是冷冻干燥的潜在替代方法。 在这里报道的研究中，使用了多种分析方法（PXRD，DSC，FT-IR和拉曼光谱）以及理论方法（分子建模）。每种方法的结果都进行了详细描述和讨论。最终，发现用于获得复合物的方法是有效的。 体内研究表明，咖啡因与CD配合使用时毒性增加。这种作用主要表现为经处理的斑马鱼胚胎死亡率增加。根据HPLC分析，以复合物形式给药时，复合物毒性增强不是咖啡因摄取增加的结果，协同毒性可能是观察到的作用的合理解释。但是，需要进一步的验证来支持它。Caf@CDs是否对温血生物具有类似作用还有待观察。 除了对Caf@CDs的毒性作进一步深入研究外，实施复合咖啡因的应用尤其值得。在这种情况下，通常还可以解决CD带来的API复杂化带来的好处。正如我们显示的Caf @CD的成功合成，可以检查这些固体的溶解度和稳定性。此外，发现咖啡因的苦味是否被复合物掩盖也将是有趣的。如果将来的研究证实与CD配合使用时咖啡因具有增强的生物活性和降低的苦味，那么在制药和食品工业中将有新的可能性。 |
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